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消毒技術規范2002(2)

發布時間:2015/8/31 15:24:21   所屬類別:新聞資訊打印】【關閉

 

 

 2.1消毒產品消毒效果檢驗技術規范

 

2.1.1 消毒劑殺微生物試驗

2.1.1.1 適用范圍

主要適用于消毒劑鑒定和日常監測,用來評價各種用途的消毒劑對微生物的殺滅效果。按此方法進行的試驗,只是對消毒劑的殺菌能力的重要方面進行驗證,側重反映消毒劑的實用劑量與殺菌能力。不能反映消毒劑的全面特性。

2.1.1.2 菌懸液與菌片的制備

2.1.1.2.1 適用范圍

制備消毒劑殺菌試驗用細菌懸液與菌片,以供消毒劑殺菌試驗時使用。

2.1.1.2.2 試驗器材

(1)菌種:金黃色葡萄球菌ATCC 6538、銅綠假單胞菌ATCC 15442、大腸桿菌8099、枯草桿菌黑色變種ATCC 9372、龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC 93326、白色葡萄球菌8032、白色念珠菌ATCC10231、黑曲霉菌ATCC16404。在上述規定的菌株基礎上,根據消毒劑特定用途或試驗特殊需要,還可增選其他菌株。

(2)有機干擾物:見附錄A。

(3)磷酸鹽緩沖液:見附錄A。

(4)無菌蒸餾水。

(5)稀釋液:見附錄A。

6)細菌培養基胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA),胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB)等,見附錄A。

(7)革蘭染色液:見附錄A。

(8)芽孢染色液:見附錄A。

(9)恒溫水浴箱。

(10)玻璃漏斗。

(11)刻度吸管(1.0ml、5.0ml、10.0ml),毛細吸管。

(12)數字可調移液器(10μl, 20μl, 100μl,200μl,1000μl)及配套用一次性塑料吸頭。

(13)離心機。

(14)電動混合器

(15)濁度計。

2.1.1.2.3 細菌懸液制備程序

(1)細菌繁殖體懸液的制備

1)取凍干菌種管,在無菌操作下打開,以毛細吸管加入適量營養肉湯,輕柔吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0 ml~10.0ml 營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置37℃培養18h~24h。用接種環取第1代培養的菌懸液,劃線接種于營養瓊脂培養基平板上,于37℃培養 18h~24h。挑取上述第2 代培養物中典型菌落,接種于營養瓊脂斜面,于37℃培養18h~24h,即為第3代培養物。


2)取菌種第3代~14代的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物(18h~24h),用5.0ml吸管吸取3.0 ml~5.0ml稀釋液加入斜面試管內,反復吹吸,洗下菌苔。隨后,用5.0ml吸管將洗液移至另一無菌試管中,用電動混合器混合(振蕩)20s,或在手掌上振敲80次,以使細菌懸浮均勻。

3)初步制成的菌懸液,先用細菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度,然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度。

4)細菌繁殖體懸液應保存在4℃冰箱內備用。應當天使用不得過夜。

5)懷疑有污染時,應以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒定。

(2)細菌芽孢懸液的制備

1)取凍干菌種管,在無菌操作下打開,以毛細吸管吸加適量營養肉湯培養基,輕柔吹吸數次,使菌種融化分散。取含5 ml~10ml營養肉湯培養基試管,滴入少許菌種懸液,置37養 18h~24h。用接種環取第1代培養的菌懸液,劃線接種于營養瓊脂培養基平板上,于37℃培養 18h~24h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落,接種于營養肉湯培養基,于37℃培養 18h~24h,即為第 3 代培養物。

2)用10.0ml 吸管吸取5.0 ml~10.0ml 第 3代~5代的18h~24h 營養肉湯培養物,接種于羅氏瓶中營養瓊脂培養基表面,將其搖動使菌液布滿營養瓊脂培養基的表面,再將多余肉湯培養物吸出,將羅氏瓶置于37℃溫箱內,培養 5d~7d。

3)用接種環取菌樣少許涂于玻片上,固定后以改良芽孢染色法染色,并在顯微鏡(油鏡)下進行鏡檢。當芽孢形成率達 95% 以上,可進行以下處理。否則,應繼續在室溫下放置一定時間,直至達到上述芽孢形成率后再進行以下處理。

改良芽孢染色法:①用接種環取菌樣涂布于玻片上,待自然干燥。而后通過火焰加熱將菌固定于玻片上。②將涂片放入平皿內,片上放兩層濾紙,滴加足量的 5.0% 孔雀綠水溶液。將平皿蓋好,放54℃~56℃ 條件下,加熱 30min。取出,去濾紙,用自來水沖洗殘留孔雀綠溶液。③加0.5% 沙黃水溶液,染1min。水洗,待干后鏡檢。芽孢呈綠色,菌體呈紅色。

4)羅氏瓶培養物,用10.0ml 吸管加10.0ml 無菌蒸餾水于每一羅氏瓶中,以L棒輕輕推刮下菌苔。吸出第一批洗下的菌懸液,再向瓶內吸加5.0ml 無菌蒸餾水,重復洗菌一遍。將第一和第二批洗下的菌懸液集中于一含玻璃珠的無菌三角燒瓶中,振搖5min,打碎菌塊,使成均勻的芽孢懸液。

5)必要時,將盛裝菌懸液的三角燒瓶置45℃水浴中 24h,使菌自溶斷鏈,分散成單個芽孢。

6)用無菌棉花或紗布過濾芽孢懸液,清除其中的瓊脂凝塊。

7)將過濾后的芽孢懸液,置無菌離心管內,以3000 r/min 速度離心 30min。棄上清液,加蒸餾水吹吸使芽孢重新懸浮。再離心和重新懸浮清洗,先后共3遍。

8)將洗凈的芽孢懸浮于三角燒瓶內蒸餾水中,并加入適量小玻璃珠。

9)將芽孢液放于80℃水浴中 10min(或60℃,30min),以殺滅殘余的細菌繁殖體。待冷至室溫后,保存于4℃冰箱中備用。有效使用期為半年。

10)芽孢懸液在使用時,應先進行活菌培養計數。

11)懷疑有雜菌污染時,應以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒定。

2.1.1.2.4 菌片的制備程序

(1)消毒試驗中使用的菌片是以菌液滴加于載體上制成。載體應根據消毒對象選擇,常用的有金屬、玻璃、濾紙、線、棉布等。根據其特點選擇適宜材料載體作為代表。載體可以為方形,大小為 10mm×10mm。 當以金屬片為載體時,因方形金屬載體在振敲時可將玻璃試管撞碎,故改用 12mm 直徑圓形金屬片(厚 0.5mm)。

(2)所用載體(除濾紙片外)于染菌前,應進行脫脂處理。脫脂方法如下:①將載體放在含洗滌劑的水中煮沸30 min;以自來水洗凈;用蒸餾水煮沸 10min;用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性;⑤晾干、熨平備用。

(3)布片用白平紋棉布制作。在剪開前,先將脫脂的布塊按載體規定的大小,抽去邊緣一周的經緯紗各一根,再按抽紗痕剪開。此法制成的載體大小一致,且無毛邊。金屬片以不銹鋼制作,紙片以新華濾紙制作。

(4)載體經壓力蒸汽滅菌后,使用滴染法染菌。

染菌用菌懸液:使用TSB營養肉湯配制。細菌繁殖體,可直接使用經18h~24h培養的斜面培養物,細菌芽孢可使用4℃冰箱貯存液。含菌量約為1×108cfu/ml~5×108cfu/ml,可使用濁度計調整菌液濃度。

滴染法染菌時,將經滅菌的載體片平鋪于無菌平皿內,逐片滴加菌液。菌液滴加量每片為10μl。用10μl移液器接滅菌塑料吸頭滴染菌液,并用接種環涂勻整個載體表面。滴染菌液后,染菌載體可置37℃溫箱內干燥(約20min~30min),或置室溫下自然陰干后再使用。

5)每個菌片的回收菌數,按活菌培養計數所得結果,應為 5×105 cfu/片~5×106 cfu/片。

2.1.1.2.5 注意事項

(1)用濁度計測定的菌懸液濃度,只用于在滴染菌片時對菌懸液稀釋度的估計。作為菌懸液含菌濃度或菌片染菌量的正式報告(如殺菌試驗中陽性對照組菌懸液或菌片所含菌量),必須以活菌培養計數的實測結果為準,不得使用根據比濁法判定的估計值。

(2)滴染時,菌液滴加量不宜過多,避免流散影響染菌的準確性。

(3)細菌繁殖體在烤干過程中,可引起部分死亡,如銅綠假單胞菌在37℃干燥過程中,滴度最高可下降1個對數值。此時,應提高初始菌濃度,以便達到所需的菌量。

(4)配制菌懸液和制備菌片時,嚴格按無菌要求操作,以防污染雜菌,影響隨后殺菌試驗的結果。

(5)用帶橡皮塞的容器保存菌液時,應將其預先煮沸10min 進行脫硫處理。

(6)制得的菌懸液和菌片,用畢應隨時放入冰箱內,盡量減少在室溫下放置時間,以減少細菌的自然死亡。

2.1.1.3 活菌培養計數技術

2.1.1.3.1 適用范圍

測定細菌懸液、菌片、采樣液等樣本中含有活菌的數量。

2.1.1.3.2 試驗器材

(1)刻度吸管(1.0ml、5.0ml)。

(2)稀釋液:見附錄A。

(3)營養瓊脂培養基:見附錄A。

(4)電動混合器

2.1.1.3.3 操作程序

本規范要求在殺菌試驗中的活菌培養計數統一使用傾注法。其操作程序如下。

(1)對菌懸液可直接進行培養計數。對菌片、采樣棉拭與小型固體樣本等,應將其上的細菌洗下成為菌懸液后進行培養計數。洗菌時,一般以稀釋液為洗液。具體方法如下: 取含 5.0ml 稀釋液無菌試管,對菌片或小型固體樣本直接投入即可,對棉拭則將其采樣端剪入管內,每管一份樣本。而后,用電動混合器混合20s(或在手掌上用力振敲 80 次),將菌洗下形成菌懸液。以上操作應嚴格按無菌要求進行。

(2)將試管按需要數量分組排列于試管架上, 每管加入 4.5ml 稀釋液。各組由左向右,逐管標上 10-1、10-2、10-3......等。

(3)將菌懸液樣本在用電動混合器混合20s(或在手掌上用力振敲 80次),隨即吸取 0.5ml加至 10-1 管內。

4)將 10-1 管依前法用電動混合器混合20s(或在手掌上用力振敲 80次),混勻,再吸取出0.5ml加入10-2 管內。如此類推,直至最后一管。必要時,還可作某稀釋度的1:1或1:4稀釋。

(5)選擇適宜稀釋度試管(以預計生長菌落數每平板為 15cfu~300cfu 者為宜),吸取其中混合均勻的懸液 1.0ml 加于無菌平皿內。每一稀釋度接種 3個平皿。一般需接種2個~3個不同稀釋度。平皿加樣前,應先按組編號,以免弄混。

(6)將冷至40~45的熔化營養瓊脂培養基,傾注于已加入樣液的平皿中,每平皿15ml~20ml。

(7)將平皿蓋好,即刻輕輕搖動混勻,平放于臺上。待瓊脂凝固后,翻轉平皿,使底向上,置37℃溫箱內培養。

(8)每日觀察細菌生長情況。培養至規定時間(細菌繁殖體為 48h,白色念珠菌與細菌芽孢為 72h),計數最終結果的菌落數。

(9)對菌片和采樣棉拭洗液的活菌培養計數,先按各試驗要求處理(如去除殘留消毒劑等),而后取其最終樣液按上法進行培養計數。

(10)計數菌落時,一般以肉眼觀察,必要時用放大鏡檢查。以菌落數在15cfu~300cfu的平板為準,每個稀釋度 3 個平板生長菌落數全合乎上述標準,則以該3個平板的菌落平均值作為結果;若有2個符合上述標準,則以該合格的兩個平板菌落的平均值為結果。但對黑曲霉菌活菌計數及殺滅試驗時,平板菌落數應在15cfu~100cfu之間。

對估計菌量極少的樣本(如消毒處理后樣本),在培養計數時可不作稀釋,即使平板菌落數未達15時,亦可用其計算最終結果。

將求得的平均菌落值,再乘以稀釋倍數,即得每毫升原樣液中的菌量。菌量單位為cfu。

2.1.1.3.4 活菌計數中技術操作誤差的測定

試驗者在活菌計數中因技術操作而引起的菌落數誤差率(平板間、稀釋度間)不宜超過10%。對誤差率的自檢,可按以下公式計算。

(1)平板間誤差率計算公式:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

(2)稀釋度間誤差率計算公式:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.1.3.5 注意事項

(1)嚴格無菌操作,防止污染。

(2)認真檢查試驗器材有無破損(要特別注意試管底的裂痕和破洞),以防丟失樣本和污染環境。

(3)注意菌液的均勻分散。

(4)稀釋或取液時要準確,盡量減少吸管使用中產生的誤差。

(5)每吸取一個稀釋度樣液,必須更換一支吸管,以減少誤差。

(6)樣液接種于平皿后應盡快傾注營養瓊脂培養基,避免樣液干燥于平皿上,影響結果的準確性。

(7)傾注時瓊脂培養基溫度不得超過45℃,以防損傷細菌或真菌。傾注和搖動時,動作應盡量平穩,以利細菌分散均勻,便于計數菌落。勿使培養基外溢,以免影響結果的準確性和造成環境的污染。

(8)為提高試驗成功率,最好先用濁度計對原菌液含菌量做出估計,盡可能在首次試驗時所取的有限稀釋范圍內(2個~3個 稀釋度)即有長菌在 15cfu~300cfu 之間的平板。

(9)結果計算時,必須弄清稀釋倍數,以免計算錯誤。

2.1.1.4 殘留消毒劑的去除方法

2.1.1.4.1  目  的

在化學消毒試驗中,達到規定消毒時間終點時,要求立即終止殘留消毒劑的繼續作用,以便準確檢測出消毒體系中殘留存活的微生物及其數量。因為消毒體系中殘留的消毒劑,可能對微生物的生長繁殖具有一定抑制作用,從而可導致對殺菌效果偏高的錯誤判斷,甚至產生假陰性結果。殘留消毒劑的去除(下簡稱除藥),可排除殘留消毒劑對微生物的抑制,從而使試驗獲得正確結果。

2.1.1.4.2 除藥的原則

(1)可有效去除殘留的消毒劑。

(2)對微生物無害,不減少微生物應有的回收量。

(3)不破壞培養基的營養成份,不影響其透明度。

(4)必須按規定方法進行鑒定試驗,并認為合格者方可在相應的消毒試驗中使用。

2.1.1.4.3 除藥的方法

(1)化學中和法:又稱中和劑法,是指在消毒劑與微生物作用到達規定時間的終點時,取樣加于適宜種類和濃度的中和劑中,將殘留消毒劑迅速中和,使其不再持續抑制或殺滅微生物的方法。本法同時含有稀釋作用效果(至少1:1稀釋,常用1:10稀釋),是最為普遍使用的方法。

對常用消毒劑,雖有一些中和劑介紹,但在實際應用中由于情況多變,效果不一定都理想。所以,在消毒試驗前仍應將擬用中和劑按試驗具體情況,經鑒定合格后再使用。

操作要點:①對接觸消毒劑的微生物樣本,在達到規定作用時間,即刻取樣移入鑒定合格的中和劑溶液中;②所用中和劑的濃度與容量應與鑒定試驗結果規定的相同;③即刻混勻,并按規定時間吸取樣液進行隨后的培養檢測;④在將樣本接種培養基以前的操作,應按規定時間內進行,以免微生物與中和劑或中和產物接觸過久。

(2)過濾沖洗法

將經消毒劑作用過的微生物樣本,立即加入適量稀釋液中混勻(通過適量稀釋,可減輕消毒劑的持續作用),并傾入裝有微孔濾膜的濾器內,接真空泵抽吸過濾(或加壓過濾)后,再加適量稀釋液沖洗,同時過濾,可去除殘留的消毒劑。多用于難以找到適宜中和劑的消毒劑試驗中,如以植物提取物制備的消毒劑。本除藥方法應按擬進行試驗具體情況,經鑒定合格后再使用。

操作要點:①準備好裝有相應孔徑微孔濾膜的濾器;②濾膜及濾器需先經滅菌處理;③初次過濾后,應使用一定量對微生物無害的稀釋液進行沖洗,沖洗次數一般以洗凈消毒劑為準;④最后一次沖洗、濾凈后,將微孔濾膜以無菌操作法取出,進行隨后的培養檢測。

(3)稀釋法

將經消毒劑作用過的微生物樣本,用稀釋液稀釋,降低殘留消毒劑濃度,以消除對微生物的抑制作用。但若稀釋過多,微生物濃度下降,可出現假陰性結果。本法可單獨使用,但更常見的是與其它方法同時使用。單獨使用時,一般多用于濃度系數較高的消毒劑(如醇類消毒劑)。本法應按擬進行試驗具體情況,經鑒定合格后再使用。

操作要點:①對接觸消毒劑的微生物樣本,在達到規定作用時間后,即時以對微生物無害的稀釋液稀釋,稀釋比例隨試驗需要決定;②電動混合或敲打振蕩,使之混勻;③吸取稀釋樣液進行隨后培養檢測。

2.1.1.4.4 注意事項

(1)處理時應嚴守無菌操作要求,所有試液須無菌,接觸樣本和試液的器材(如吸管、平皿、試管、濾材等)亦均須經滅菌,以免污染樣本,影響試驗結果。

(2)每次吸液,均須更換一支無菌吸管,以防交叉污染。此點由于操作繁瑣,器材需求量大,往往不能認真執行,應加以注意。

(3)為保證試驗的準確性,所用吸管的容量應盡量與擬吸取的液體量相近,不要用大吸管吸取少量液體;試驗樣本的混勻操作,必須認真進行;盡量減少中和劑或中和產物與試驗微生物的接觸時間。

(4)所用方法適宜與否,和消毒劑性質、復方中的附加成份、試驗微生物種類、消毒試驗種類等等均有關系,試驗條件稍有改變就可能影響除藥效果。故每進行一種消毒試驗(包括消毒劑或微生物的更換),均需按規定對所選方法進行鑒定試驗,合格者方可用于正式試驗。此步驟絕不可省略,否則極有可能導致試驗產生錯誤結果。

2.1.1.5 中和劑鑒定試驗

2.1.1.5.1 目 的

確定所選中和劑是否適用于擬進行的細菌和真菌殺滅試驗。

2.1.1.5.2 試驗器材

(1)試驗菌菌懸液和菌片(見 2.1.1.2)。

(2)刻度吸管(1.0ml、5.0ml)。

(3)小平皿(4 cm~6cm 直徑)。

(4)恒溫水浴箱。

(5)稀釋液:見附錄A。

(6)胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA):見附錄A。

(7)電動混合器

2.1.1.5.3 試驗設計原則

(1)通過所設各組試驗結果綜合分析,應可確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用,對試驗用細菌以及其恢復期培養是否有害或不良影響。

(2)在確定用何種中和劑進行鑒定試驗有困難時,可對多個中和劑進行初選以確定(見本款文后【附】)。

(3)試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低,則不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部中和。

(4)鑒定試驗中,消毒后去除殘留消毒劑組(第2組)無菌生長,不能表明中和后受到消毒劑作用后的細菌是否能恢復生長。細菌是否復蘇。此時可適當縮短作用時間重新進行試驗,但作用時間最短不得少于30s,否則難以控制試驗的準確性。若縮短作用時間后仍無菌生長,在排除其他原因的基礎上,可適當下調殺菌試驗中消毒劑濃度,再次進行中和劑鑒定試驗。

(5)同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時,應按微生物種類分別進行鑒定試驗。對細菌繁殖體,在大腸桿菌(8099)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、銅綠假單胞菌(ATCC 15442)中任選其一進行試驗即可;對細菌芽孢,以枯草桿菌黑色變種(ATCC 9372)芽孢進行。

當用其他特定微生物進行殺滅試驗時,均應以該特定微生物進行中和劑的鑒定試驗。

(6)鑒定時根據所用殺菌試驗方法,使用相應的懸液或載體定量試驗。

【附】中和劑初選試驗

中和劑鑒定試驗前,若難確定擬檢測的中和劑,可通過本試驗初選,而后以選中的中和劑進行正式的鑒定試驗。初選操作程序如下:

(1)將0.5ml 試驗菌懸液(含菌量為 1×103 cfu/ml~3×103 cfu/ml)加入含 4.5ml 中和劑試管中,混勻,作用30min后,取1.0ml接種平皿,用TSA傾注法培養。

(2)將0.5ml 試驗菌懸液(含菌量為 1×103 cfu/ml~3×103 cfu/ml)加入含 4.5ml中和產物試管中,混勻,作用30min后,取1.0ml接種平皿,用TSA傾注法培養。

(3)試驗同時設陽性對照組。陽性對照組以 0.5ml 菌懸液加入含 4.5ml 稀釋液試管中,混勻,作用30min后,取1.0ml接種平皿,用TSA傾注法培養。

3組平板上長出的菌落數接近,如果以陽性對照組為標準(X),前兩組長菌數為(X±50%X)以內,可進行正式的鑒定試驗。

2.1.1.5.4 試驗分組

第1組  消毒劑 + 菌懸液 →培養

觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制能力。

第2組  (消毒劑 + 菌懸液) + 中和劑 → 培養

觀察殘留消毒劑被中和后受到清毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長。

第3組  中和劑 + 菌懸液 → 培養

觀察中和劑是否抑菌。

第4組  (消毒劑 + 中和劑)+ 菌液 → 培養

觀察中和產物,或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。

第5組  稀釋液 + 菌懸液 → 培養

作為菌數對照。

第6組  稀釋液 + 中和劑 + 培養基 → 培養

作為陰性對照。

2.1.1.5.5 中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序 

根據試驗分組,準備足量試管和平皿,依次進行編號。將消毒劑按所需濃度配制好后,置20℃±1℃水浴中待用。

按2.1.1.2制備試驗菌懸液。取2.0ml試驗菌懸液于試管中,加入2.0ml有機干擾物質,制成含有機干擾物質的菌懸液,置20℃±1℃水浴中備用。

(1)第 1 組。吸取1.0ml含有機干擾物質的試驗菌懸液于試管內,置20℃±1℃ 水浴中 5min 后,再吸加4.0ml消毒劑于試管內,混勻。作用至預定時間,吸此樣液 0.5ml 加于含有 4.5ml 稀釋液的試管中,混勻。吸取該最終樣液1.0ml,接種于平皿中,做活菌培養計數。

(2)第2組。吸取1.0ml含有機干擾物質試驗菌懸液于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,再吸加4.0ml消毒劑于試管內,混勻。作用至預定時間,吸此樣液 0.5ml 加于含 4.5ml 中和劑溶液管中,混勻,作用10min。吸取該最終樣液1.0ml,接種于平皿中,做活菌培養計數。

如平板生長菌落數均超過 300 個,應以稀釋液對上述最終樣液作適宜稀釋后,再次進行活菌培養計數。

(3)第 3 組。吸取0.1ml含有機干擾物質的試驗菌懸液于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,加入0.4ml硬水,混勻。加入4.5ml中和劑,作用10min。用中和劑做10倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,各吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(4)第 4 組。吸取0.1ml含有機干擾物質的試驗菌懸液于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,吸加4.9ml中和產物溶液(以0.4ml消毒劑加4.5ml中和劑,作用 10min 配制而成)于試管內,混勻。作用10min,吸取該最終樣液 0.5ml,用中和產物溶液做 10 倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,各吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(5)第5組。吸取0.1ml含有機干擾物質的試驗菌懸液于試管內,置20℃±1℃ 水浴中5min 后,吸加0.4ml硬水于試管內,混勻。加入4.5ml稀釋液,作用 10min ,用稀釋液做10倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,各吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(6)第 6 組。分別吸取稀釋液、中和劑和硬水各1.0ml于同一無菌平皿內,倒入上述試驗同批次的培養基25ml,培養觀察。如出現細菌生長,可能提示試驗材料或操作過程中有污染。應重新進行試驗。

2.1.1.5.6  中和劑載體定量鑒定試驗操作程序

根據試驗分組,準備足量試管和平皿,依次進行編號。各組分別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗樣本。

(1)第1組。吸取消毒劑5.0ml于無菌小平皿內,將其置20℃±1℃水浴中5min后,用無菌鑷子夾入一菌片,并使浸透于消毒液中。待作用至試驗預定的時間,立即用無菌鑷子取出菌片移入含5.0ml稀釋液試管中,作用10min。用電動混合器混合20s,或將試管振打80次,吸取該最終樣液 1.0ml,接種于平皿中,做活菌培養計數。

(2)第 2 組。吸取消毒劑 5.0ml 于無菌小平皿內,將其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,用無菌鑷子夾入一菌片,并使浸透于消毒液中,待作用至試驗預定時間,立即用無菌鑷子取出菌片移入含 5.0ml 中和劑試管中,用電動混合器混合20s,或將試管振打80 次。作用10min,吸取該最終樣液1.0ml,分別接種于各平皿中,做活菌培養計數。

如平板生長菌落數均超過 300個, 應重新吸取該最終樣液 0.5ml,用稀釋液做適當稀釋,選適宜稀釋度懸液,吸取1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(3)第 3 組。吸取中和劑 5.0ml 于無菌小平皿中,將其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,用無菌鑷子夾入 1 菌片,并使浸透于中和劑內,作用 10min。立即用無菌鑷子取出菌片移入含5.0 ml 中和劑試管中,用電動混合器混合20s,或將試管振打80 次,混勻。吸取該最終樣液 1.0ml,用中和劑做 10 倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(4)第 4 組。 吸取中和產物溶液 (以一片浸有消毒劑的載體置 5.0ml 中和劑內,作用10min) 5.0ml 于無菌小平皿內,將其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,用無菌鑷子夾入 1 菌片,并使浸透于中和產物溶液中。作用 10min,用無菌鑷子取出菌片,移入含 5.0ml 中和產物溶液的試管中,用電動混合器混合20s,或將試管振打 80 次,混勻。吸取該最終樣液0.5ml,用中和產物溶液做10 倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(5)第 5 組。吸取稀釋液 5.0ml 于無菌小平皿內,將其置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后, 用無菌鑷子夾入 1 菌片,并使浸透于稀釋液中。作用10min,立即用無菌鑷子取出菌片移入含 5.0ml 稀釋液的試管中,用電動混合器混合20s,或將試管振打 80 次,混勻。吸取該最終樣液0.5ml,用稀釋液 做10倍系列稀釋,選適宜稀釋度懸液,吸取 1.0ml,分別接種于平皿中,做活菌培養計數。

(6)第 6 組。分別吸取稀釋液與中和劑各1.0ml于同一無菌小平皿內,倒入上述試驗同批次的培養基15ml~20ml,培養觀察。如出現細菌生長,提示試驗材料或操作過程中可能有污染。應重新進行試驗。

2.1.1.5.7  評價規定

試驗結果符合以下全部條件,所測中和劑可判為合格:

(1) 第 1 組無試驗菌,或僅有極少數試驗菌菌落生長。

(2) 第 2 組有較第 1 組為多,但較第 3、4、5(組)為少的試驗菌菌落生長,并符合表 2-1 要求者。

表 2-1  中和劑鑒定試驗合格標準中對第 1 組與第 2 組菌落數的要求

第 1 組平板平均菌落數

第 2 組平板平均菌落數

0

>5

X(1~10)

>(X + 5)

Y(>10)

>(Y + 0.5 Y)

注:對抑菌作用不明顯消毒劑(如乙醇)所用中和劑的鑒定試驗中,當第 1 組與第 2 組菌落數相近,難以達到本表要求時,可根據具體情況另行作出判斷和評價。

3) 第 3、4、5有相似量試驗菌生長,懸液試驗在1×107 cfu/ml~5×107 cfu/ml之間,載體試驗在 5×105 cfu/片~5×106 cfu/片 之間。其組間菌落數誤差率應不超過 15%。第3、4、5 組間菌落數誤差率計算公式其計算公式如下。

 

 

 

 

 

 

(4)第6組無菌生長。否則,說明試劑有污染,應更換無污染的試劑重新進行試驗。

(5)連續 3 次試驗取得合格評價。

2.1.1.5.8  注意事項

(1)試驗所分各組均有其特定意義,不得任意刪減。

(2)嚴守無菌操作,保持試液和器材的無菌,注意更換吸管,以防止沾染影響試驗的準確性。

(3)在計算微生物濃度時,須考慮其稀釋倍數。

(4)試驗組序應按本規范所列排列。

2.1.1.6 物理法去除殘留消毒劑試驗

2.1.1.6.1 目 的 

通過本鑒定試驗,確定常用的物理去除法是否可去除消毒體系中殘留的消毒劑,使消毒劑鑒定試驗顯示出真正的殺菌效果。

2.1.1.6.2 試驗器材

(1)過濾沖洗法需用經過滅菌處理的濾器、微孔濾膜、真空泵(或抽濾泵)。

(2)離心沉淀法需用離心機與離心管。

(3)吸附柱、分子篩柱(主要供病毒滅活試驗用)。

(4)無菌稀釋液、沖洗液。要求不應影響除藥材料(如濾膜、吸附柱等)的性質,對微生物無傷害作用。常用的有:水、緩沖液(如PBS)、稀釋液、含0.1%~0.5%吐溫80的PBS、中和劑(可中和部分消毒成分)。

(5)其他器材隨所用試驗微生物而定。

2.1.1.6.3 試驗設計原則

(1)通過所設各組試驗結果綜合分析,應可確定所選方法是否對測試消毒劑有良好的去除作用,對試驗用微生物以及其恢復期培養是否有害或不良影響。

(2)試驗中所用消毒劑的濃度應以殺菌試驗中使用的最高濃度為準。濃度過低不足以顯示能否將高濃度消毒劑全部去除。

(3)鑒定試驗中,消毒后去除殘留消毒劑組無微生物生長,不能表明去除處理后細菌是否復蘇。此時可增加處理時間或次數,亦可適當縮短作用時間再試。作用時間最短不得少于30s,否則難以控制試驗的準確性。

(4)同一消毒劑擬對多種微生物進行殺滅試驗時,所用物理去除消毒劑法應按微生物種類分別進行鑒定試驗,不得互相取代。對細菌繁殖體的試驗,可在大腸桿菌(8099)、銅綠假單胞菌(ATCC 15442)或金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)中任選其一進行試驗即可;對細菌芽孢,以枯草桿菌黑色變種(ATCC 9372)芽孢進行。

當用其他特定微生物 (如龜分枝桿菌膿腫亞種) 進行殺滅試驗時,均應以該特定微生物再次進行去除消毒劑方法的鑒定試驗。

(5)鑒定中應根據正式殺滅試驗的設計,選擇使用懸液定量試驗,還是載體定量試驗。通常,懸液鑒定試驗結果可用于載體試驗。

2.1.1.6.4  物理去除方法的鑒定

(1)分組方法如下:

1)消毒劑 + 菌懸液 → 培養

觀察消毒劑對試驗菌有無殺滅或抑制作用。

2)(菌懸液 + 消毒劑) + 過濾沖洗法處理 → 培養

觀察所用去除消毒劑處理后,受到消毒劑作用后的試驗菌是否能恢復生長。

3)(菌懸液 + 水) +過濾沖洗法處理 → 培養

觀察去除消毒劑處理是否影響試驗菌的生長數量。

4)菌懸液 → 培養 

作為菌懸液陽性對照值。

(2)操作程序如下:

1) 第 1 組。吸取0.5ml試驗菌懸液于試管內,加入0.5ml有機干擾物質,混勻后,20℃±1℃ 水浴中 5min 后,再吸加4.0ml消毒劑(應先置 20℃±1℃中水。┯谠嚬軆,混勻,作用至試驗預定時間。吸取該最終樣液0.5ml,加于含4.5ml 稀釋液試管中,混勻。吸取最終樣液 1.0ml 接種于平皿內,做活菌培養計數。

2) 第 2 組。吸取0.5ml試驗菌懸液于試管內,加入0.5ml有機干擾物質,混勻后,20±1 水浴中 5min 后,再吸加4.0ml消毒劑于試管中,混勻。作用至試驗預定時間,對其進行去除消毒劑處理,并取最終樣液 1.0ml 接種于平皿內,做活菌培養計數(如為濾膜法,可直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面)。如平皿生長菌落數均超過300 個,應再吸取該最終樣液 0.5ml,用 PBS 做適當稀釋,選擇適宜稀釋度懸液,吸取 1.0ml,分別接種于平皿內,做活菌培養計數。

3) 第 3 組。吸取0.5ml試驗菌懸液于試管內,加入0.5ml有機干擾物質,混勻后,20±1 水浴中 5min 后,再吸加4.0ml硬水于試管內,混勻。不加消毒劑,做同上處理。取最終樣液 0.5 ml 用稀釋液做 10 倍系列稀釋,選擇 2個~3個適宜稀釋度懸液,各取 1.0ml,分別接種于平皿內,做活菌培養計數(如為濾膜法,可先進行10 倍系列稀釋,再經過濾沖洗法處理,然后直接將濾膜有菌面朝上貼于平板表面)。

4) 第 4 組。吸取試驗菌懸液 1.0ml,置含 4.ml 稀釋液的試管中,不加消毒,亦不作任何去除處理,進行活菌培養計數,作為陽性對照值。

(3) 評價規定

試驗結果符合以下全部條件,所測中和劑可判為合格:

1) 第 1 組無試驗菌,或僅有極少數生長。

2) 第 2 組有遠較第 1 組為多,但較第 3、4(組)為少的試驗菌生長。在第 1 組無菌生長時,第 2 組平均每個平板 (或濾膜) 上生長菌落不少于 5 個。

3) 第 3、4 (組)測定的結果,微生物數量應在 1×107 cfu/ml~5×107 cfu/ml 之間,其組間差不得超過兩組回收菌數平均值的50%。組間差的計算可按下式進行:

 

 

 

4)連續 3 次試驗取得合格評價。

5)本規范推薦使用過濾沖洗法。

2.1.1.6.5 注意事項  見 2.1.1.5.8。

2.1.1.7 細菌定量殺滅試驗

2.1.1.7.1 目 的 

在實驗室內測定消毒劑殺滅懸液中或載體上細菌繁殖體和細菌芽孢所需劑量,以驗證實用消毒劑量。

2.1.1.7.2 試驗器材

(1)按 2.1.1.2 所示方法制備的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和枯草桿菌黑色變種芽孢懸液或菌片。此外,根據消毒劑特定用途或試驗特殊需要,準備其他菌種的懸液或菌片。

(2)消毒劑溶液除有特殊規定者外,應使用無菌硬水配制。消毒劑溶液濃度應以所含有效成份為準。例如,含氯消毒劑以所含有效氯濃度為準,碘伏以所含有效碘為準,過氧乙酸以所含過氧乙酸量為準,復方消毒劑濃度以主要殺菌有效成分含量為準。各組消毒劑溶液有效成份濃度的計算,應以試驗菌與消毒劑的混合液中有效成份的最終濃度為準。

(3)去除殘留消毒劑的中和劑或設備 (經鑒定試驗證實合格的中和劑或有關器材)。

(4)消毒劑稀釋用硬水:見附錄A。

(5)有機干擾物質。懸液試驗用3%BSA溶液,載體試驗直接用TSB(見附錄A)。

(6)TSA培養基:見附錄A。

(7)含中和劑的胰蛋白胨大豆肉湯培養基(中和劑TSB),中和劑經鑒定合格。

(8)刻度吸管 (1.0ml、5.0ml)。

(9)恒溫水浴箱。

(10)噴霧器(用于噴霧消毒試驗)。

(11)電動混合器。

(12)秒表。

2.1.1.7.3 試驗分組

試驗中應分以下各組:

(1)試驗組。按測試目的有兩種選擇。

第一種適用于消毒產品鑒定。根據本規范中表1-1和使用說明書,選定試驗菌和一個消毒劑濃度(即產品使用說明書中指定的最低濃度)以及3個作用時間(說明書指定最短作用時間,指定最短作用時間的0.5倍,指定最低作用時間的1.5倍。如說明書指定最短作用時間為20min,則應進行10min、20min、30min 三個時間)進行試驗。

第二種適用于消毒產品監督機構日常監測。根據所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力,選定一株抗力較強的菌和一個消毒劑濃度(即產品使用說明書中指定的最低濃度)以及一個作用時間(說明書指定最短作用時間)進行試驗。

(2)陽性對照組。根據各種試驗的規定,用稀釋液代替消毒劑溶液,按上述同樣的步驟進行試驗。所得結果代表菌液原有濃度,以其作為計算殺滅對數的初始濃度。

2.1.1.7.4 懸液定量殺菌試驗操作程序

(1)首先按產品說明書要求配制消毒液。無特殊說明者,一律使用無菌硬水配制,配制的濃度為待測濃度的1.25倍(例如要評價的消毒液濃度為200mg/L,則應配制250mg/L),置20℃±1℃ 水浴備用。

(2)按照2.1.1.2 配制實驗用菌懸液,濃度為1×108cfu/ml~5×108cfu/ml。

(3)取消毒試驗用無菌大試管,先加入0.5ml試驗用菌懸液,再加入0.5ml有機干擾物質,混勻,置 20℃±1℃ 水浴中 5min后,用無菌吸管吸取上述濃度消毒液 4.0 ml 注入其中,迅速混勻并立即記時。

(4)試驗與消毒劑相互作用至各預定時間,分別吸取0.5ml試驗與消毒劑混合液加于 4.5ml 經滅菌的中和劑中,混勻。

(5)各管試驗與消毒劑混合液經加中和劑作用 10min 后,分別吸取 1.0ml樣液,按活菌培養計數方法測定存活菌數,每管樣液接種 2 個平皿即可。如平板上生長的菌落數較多時,可進行系列10倍稀釋后,再進行活菌培養計數。

(6)同時用稀釋液代替消毒液,進行平行試驗,作為陽性對照。

(7)所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養,對細菌繁殖體培養48h 觀察最終結果;對細菌芽孢需培養 72h 觀察最終結果。

(8)試驗重復3次,計算各組的活菌濃度(cfu/ml),并換算為對數值(N),然后按下式計算殺滅對數值:

殺滅對數值 (KL)=對照組平均活菌濃度的對數值(No)-試驗組活菌濃度對數值(Nx)

計算殺滅對數值時,取小數點后兩位值,可以進行數字修約。如果消毒試驗組消毒處理后平均生產菌落數,小于等于1時,其殺滅對數值,即大于等于試驗前對照組平均活菌濃度的對數值。

2.1.1.7.5 載體浸泡殺菌試驗操作程序

(1)載體浸泡定量殺菌試驗操作程序

1)取無菌小平皿,標明所注入消毒液的濃度。按每片 5.0ml 的量,吸取相應濃度的消毒劑溶液注入平皿中。

2)將盛有消毒劑平皿置 20℃±1℃ 水浴箱內 5min 后,用無菌鑷子分別放入預先制備的菌片 3 片,并使之浸透于消毒液中。

3)待菌藥相互作用至各預定時間,用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含 5.0ml 中和劑試管中。用電動混合器混合20s,或將試管在手掌上振敲 80 次,使菌片上的細菌被洗脫進入中和液中,再放置5min以上,使中和作用充分。最終進一步混勻后,吸取 1.0ml 直接接種平皿,每管接種 2 個平皿,測定存活菌數。

4)另取一平皿,注入 10.0ml 稀釋液代替消毒液,放入 2 片菌片,作為陽性對照組。其隨后的試驗步驟和活菌培養計數與上述試驗組相同。

5)所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養,對細菌繁殖體培養48h 觀察最終結果;對細菌芽孢需培養 72h 觀察最終結果。

6)試驗重復 3 次 (包括對照),計算各組的活菌量(cfu/片),并換算為對數值(N),然后按2.1.1.7.4(8)公式計算殺滅對數值。

(2)載體浸泡定性滅菌試驗操作程序

1)取無菌小平,標明所注入消毒液的濃度。按每片5.0ml的量,吸取相應濃度的消毒劑溶液注入平皿中。

2)將盛有消毒劑平皿置20℃±1℃水浴箱內5min后,用無菌鑷子分別放入預先制備的菌片6片,(每個作用時間2片菌片)并使之浸透于消毒液中。

3)待試驗菌與消毒液相互作用至各預定時間,用無菌鑷子將菌片取出分別移入一含5.0ml中和劑TSB試管中。用電動混合器混合20s,作為試驗組樣本。

4)另取一平皿,注入20.0ml硬水代替消毒液,放入4片菌片,作用至預定時間,取出2片,分別移入含5ml中和劑TSB試管中。其隨后的試驗步驟與上述試驗組相同,作為陽性對照組樣本。另取出2片,分別移入一含5.0ml中和劑試管中,用電動混合器混合20s,或將試管在手掌上振敲80次,然后用稀釋液做10倍系列稀釋,選擇適宜稀釋度,吸取1.0ml接種平皿,每管接種2個平皿,做活菌培養計數,作為菌數對照組樣本。

5)所有試驗樣本均在37℃溫箱中培養,對細菌繁殖體培養48h,觀察最終結果;對細菌芽孢需培養7d,觀察最終結果。

6)試驗重復5次(包括對照),計算各組的活菌量(cfu/片)。

2.1.1.7.6 載體噴霧定量殺菌試驗操作程序

(1)根據所試菌種和消毒劑對該菌的殺滅能力,選定1個消毒劑濃度(即產品使用說明書中指定的最低濃度)和 3 個作用時間(說明書指定最短作用時間,指定最短作用時間的0.5倍,指定最低作用時間的1.5倍。如說明書指定最短作用時間為20min,則應進行10min、20min、30min 三個時間)進行試驗。

(2)選定消毒劑的濃度與作用時間。每種菌所染菌片應分開進行試驗。試驗時,每種載體菌片各取 3 片,以等邊三角形或三角形陣列,均勻排布于一未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板上(如無菌平皿內)。

(3)每批試驗以同一濃度消毒劑溶液對上述排列的菌片進行均勻噴霧。每次噴霧的距離和壓力保持一致,以盡量使噴到菌片上的霧粒大小和數量一致。噴霧量以不使菌片濕透、流液為度。

(4)試驗與消毒劑相互作用至各規定時間,取每種載體菌片 1 片,各放入一含 5.0ml 中和劑的無菌試管中。將試管用電動混合器混合20s,或在手掌上振敲 80 次,使菌片上細菌被洗脫進入中和液中。

(5)吸取 1.0ml 上述洗液,按活菌培養計數方法測定存活菌數,每管接種 2 個平皿。

(6)每批試驗均應換一塊未沾有任何消毒劑的清潔無菌玻璃板。噴霧器換裝新濃度消毒劑前,應將原殘留消毒劑洗凈,再換裝新濃度消毒劑。

(7)用硬水代替消毒液,按同樣的噴霧方法進行處理,作為陽性對照組。如為壓力罐裝自動噴霧式氣霧消毒劑,可直接用染菌載體作活菌計數,作為處理前陽性對照組。

(8)所有試驗樣本均在 37℃ 溫箱中培養,對細菌繁殖體培養48h 觀察最終結果;對細菌芽孢需培養 72h 觀察最終結果。

(9)試驗重復 3 次,計算各組的活菌數(cfu/片),并換算為對數值(N),然后按2.1.1.7.4(8)公式計算殺滅對數值。

2.1.1.7.7 定量殺菌試驗的評價規定

(1)產品監督檢驗,在產品說明書指定的最低濃度與最低作用時間,重復試驗3次。要求懸液定量殺滅試驗中,各次的殺滅對數值均5.00,可判定消毒合格。要求載體定量殺滅試驗,各次的殺滅對數值均≥3.00,可判定消毒合格。

(2)產品申報衛生許可檢驗中,要求在產品說明書指定的濃度與3作用時間,重復試驗3次。在產品指定最低濃度與最短作用時間,以及最短作用時間的1.5倍時,要求懸液定量殺滅試驗中各次的殺滅對數均應≥5.00。要求載體定量殺滅試驗中,各次的殺滅對數均應≥3.00,可判定為消毒合格。在產品指定濃度與最短作用時間的0.5倍時,可容許對不同細菌或在部分重復次數中,出現不合格結果。

(3)對載體浸泡定性滅菌試驗,陽性對照組應有菌生長,菌數對照組符合要求,陰性對照組應無菌生長,5次試驗所有作用時間均無菌生長為滅菌合格。

(4)報告中應將各此試驗的結果全部以表格的形式列出。陽性對照組應列出各次試驗菌濃度,以及平均試驗菌濃度。試驗組應列出殺滅對數值,殺滅對數值大于5.00時,應表示為5.00,而不必列出具體的數字;殺滅對數值小于5.00時,應列出具體的數字(例如2.58,4.65)。

2.1.1.7.8 注意事項

(1)在殺菌試驗中,每次均應設置陽性對照。

(2)試驗中所使用的中和劑、稀釋液和培養基等,各批次均應進行無菌檢查,發現有菌生長,則全部試驗需換用未污染試劑或培養基重做。

(3)懸液定量殺菌試驗時,有機干擾物質一般采用3%(W/V)牛血清白蛋白貯存溶液,取0.5ml加入到消毒體系中(稀釋10倍),進行消毒試驗。如果某消毒劑使用說明書中指定,其產品只用于清潔物品或器械的消毒或只清洗消毒,可采用0.3%(W/V)牛血清白蛋白貯存溶液,取0.5ml加入到消毒體系中(稀釋10倍),進行消毒試驗。

2.1.1.8殺滅分枝桿菌試驗

2.1.1.8.1 目的  

在實驗室內測定消毒劑殺滅懸液中或載體上分枝桿菌所需劑量,以驗證對分枝桿菌(包括結核桿菌)實用消毒劑量。

2.1.1.8.2 試驗器材

(1) 試驗菌株 龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC 93326。

(2) 培養基 分枝桿菌干燥培養基(上海奧普生物醫藥有限公司)。

(3) 試驗菌及其菌懸液或菌片的制備。

(4) 中和劑 (根據 2.1.1.5 所示方法鑒定合格者)。

(5) 稀釋液 0.1% 胰蛋白胨的生理鹽水溶液。

(6) 消毒劑稀釋用硬水:見附錄A。

(7) 有機干擾物質:見附錄A。

(8) 刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

(9) 恒溫水浴箱。

(10) 噴霧裝置(用于噴霧消毒試驗)。

(11) 電力混合器。

(12) 計時裝置。

(13) 恒溫培養箱。

2.1.1.8.3 龜分枝桿菌膿腫亞種 ATCC 93326 菌懸液的制備

(1)取凍干菌種管,以無菌操作打開,用毛細吸管吸加適量營養肉湯于管中,輕柔吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0 ml~10.0mlMADC肉湯或羅氏肉湯試管,滴入少許菌種懸液,置 37℃培養 18h~24h。用接種環取第 1 代培養的菌懸液,劃線接種于分枝桿菌培養基平板上,于 37℃ 培養 72h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落,接種于分枝桿菌培養基斜面,于 37℃ 培養 72h,即為第3代培養物。密封后,在4℃保存,時間不得超過6周。

(2)試驗時取第3代斜面培養物,在分枝桿菌瓊脂斜面上連續傳代,培養方法與第3代相同。取第5代~6代的分枝桿菌培養基斜面新鮮培養物(72h),用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml~5.0ml 稀釋液加入斜面試管內,反復吹吸,洗下菌苔。隨后,用 5.0ml 吸管將洗液移至一含有6-7g玻璃珠的無菌圓錐底試管中,在電動混合器混合至少5min。然后將菌液吸入到另一試管內制成菌懸液。

3)將制成的菌懸液,進行活菌培養計數(見 2.1.1.3),按其結果用稀釋液稀釋至所需濃度。

(4)菌懸液保存在4℃ 冰箱內備用。當天使用不得過夜。

2.1.1.8.4 試驗分組

    試驗分為下列各組:

    (1) 試驗組,按 2.1.1.7.3 規定,選定消毒劑濃度與作用時間。

    (2) 陽性對照組, 以硬水代替消毒劑溶液,按 2.1.1.7.3 規定程序進行試驗。所得結果代表試驗體系中所含受試菌的初始濃度,并以其計算消毒因子對受試菌的殺滅對數值。

    (3) 陰性對照組,觀察同次試驗用相關溶液和培養基有無污染。

2.1.1.8.5 試驗程序

常用殺滅試驗有: 懸液定量殺滅試驗、載體浸泡定量殺滅試驗、載體噴霧定量殺菌試驗等。其操作程序詳見 2.1.1.7.4,2.1.1.7.5,2.1.1.7.6。接種后的平皿應放入干凈的塑料袋內,在37℃中培養1周,觀察最終結果。

2.1.1.8.6 評價規定

(1) 產品監督檢驗,按產品使用說明書指定的使用濃度和作用時間,重復試驗3次,要求懸液定量殺滅試驗各次試驗的殺滅對數值均 ≥4.00 ,要求載體定量殺滅試驗,各次試驗的殺滅對數值均≥3.00,可判定該產品對分枝桿菌污染物消毒合格。

(2)產品鑒定檢驗,按產品使用說明書指定的使用濃度和 3 個作用時間,重復試驗 3 次,在產品使用說明書規定使用濃度與最短作用時間,以及最短作用時間的1.5倍時,各次試驗的殺滅對數值均應≥4.00,在產品使用說明書規定使用濃度與最短作用時間的0.5倍時,允許殺滅對數值<4.00,可判為實驗室試驗該產品對分枝桿菌污染物消毒的有效劑量。

用載體浸泡定量殺滅試驗評價殺菌效果時,在產品使用說明書規定使用濃度與最短作用時間,以及最短作用時間的1.5倍時,各次試驗的殺滅對數值≥3.00,在產品使用說明書規定的使用濃度與最短作用時間的0.5倍時,允許殺滅對數值<3.00,可判為試驗室試驗該產品對分枝桿菌污染物消毒的有效劑量。

2.1.1.9 真菌殺滅試驗

2.1.1.9.1 目的

在實驗室內測定消毒劑殺滅懸液中或載體上真菌繁殖體或真菌孢子所需劑量,以驗證對真菌及其孢子實用消毒劑量。

2.1.1.9.2試驗器材

    (1) 麥芽浸膏瓊脂(MEA):見附錄A。

    (2) 沙堡瓊脂培養基:見附錄A。

(3) 試驗菌及其菌懸液或菌片的制備

白色念珠菌ATCC 10231 和黑曲霉菌ATCC 16404 或孢子懸液與菌片按 2.1.1.9.3(1) 和 2.1.1.9.3(2) 所示方法制備。

    此外,根據消毒劑特定用途和特殊需要,可選用其它真菌或孢子懸液與菌片。

(4)中和劑 (根據 2.1.1.5 所示方法鑒定合格者)。

(5)磷酸鹽緩沖液( PBS, 0.03 mol/L,pH7.2)。

(6)消毒劑稀釋用硬水:見附錄A。

(7)有機干擾物質:見附錄A。

(8)刻度吸管 (0.1ml、1.0ml、5.0ml)。

(9)恒溫水浴箱。

(10)噴霧裝置(用于噴霧消毒試驗)。

(11)電動混合器。

(12)計時裝置。

2.1.1.9.3 真菌懸液制備

(1)白色念珠菌懸液的制備

1)取凍干菌種管,以無菌操作打開,用毛細吸管吸加適量沙堡液體培養基于管中,輕柔吹吸數次,使菌種融化分散。取含 5.0ml~10.0ml 沙堡液體培養基試管,滴入少許菌種懸液,置 37℃培養 18h~24h。用接種環取第 1 代培養的菌懸液,劃線接種于沙堡瓊脂培養基平板上,于 37℃ 培養 18h~24h。挑取上述第 2 代培養物中典型菌落,接種于沙堡瓊脂斜面,于 37℃ 培養 18h~24h,即為第 3 代培養物。將其密封后在4℃保存,時間不得超過6周。

2)試驗時,取第3代斜面培養物在砂堡瓊脂斜面上連續傳代,方法與第3代相同。取第5代或6代的沙堡瓊脂培養基斜面新鮮培養物(18h~24h),用 5.0 ml 吸管吸取 3.0ml~5.0ml 稀釋液加入斜面試管內,反復吹吸,洗下菌苔。隨后,用 5.0ml 吸管將洗液移至另一無菌試管中,用電動混合器混合20s,或在手掌上振敲 80次,以使白色念珠菌菌懸浮均勻。

3)懸液殺菌試驗時,實驗用菌懸液的含菌量為1×107cfu/ml~5×107cfu/ml;菌片制備按2.1.1.2 要求進行。

4)菌懸液保存在 4℃ 冰箱內備用。當天使用不得過夜。

5)懷疑有污染時,應以菌落形態、革蘭染色與生化試驗等法進行鑒定。菌落形態可直接用顯微鏡觀察。菌體形態可在涂片后直接用高倍顯微鏡觀察,也可用墨水陰地法染色(將菌與黑墨水在玻片上混勻,推成薄膜)后觀察。

(2)黑曲霉ATCC 16404 懸液或菌片的制備。 

1) 取凍干菌種管,以無菌操作打開,毛細管吸取少量麥芽浸膏肉湯培養基加到菌種管中,輕輕吹吸,使菌種沉淀物融化分散。取少許沉淀物懸液加到含5.0ml麥芽浸膏營養肉湯培養基試管中,置30±1培養42h~48h。用接種環劃線接種第1代培養物于MEA培養基平板,置30±1培養箱中培養 42h~48h。取平板培養物中的典型菌落,接種于麥芽浸膏營養瓊脂斜面培養基,置 30℃±1℃培養箱中培養 42h~48h,即為第3代培養物。將其密封后在4℃保存,時間不得超過9周。

2) 試驗時,取第3代斜面培養物接種麥芽浸膏瓊脂斜面,30℃培養48h,取得3.0~5.0ml麥芽浸膏肉湯,洗下斜面上的培養物,接種羅氏瓶,并搖動使菌液布滿 MEA 培養基表面,然后吸棄多余肉湯培養物液體,置 30℃±1℃ 培養 7d~9d。

3) 向羅氏瓶培養物中加入5.0 ml~10.0ml 0.05%(V/V)吐溫 80 生理鹽水溶液,刮洗黑曲霉分生孢子于溶液中,將孢子懸液移入裝有玻璃珠的三角瓶中,輕輕振搖 1min 后,濾過除去菌絲。濾過后,顯微鏡下(400 倍)觀察是否存在菌絲,若懸液中有菌絲存在,可經 5000 r/min~6000 r/min,離心 20min。再次在顯微鏡下(400 倍)觀察,若懸液中仍有菌絲存在,須再離心。

4) 黑曲霉分生孢子懸液在 2~8 儲存不能超過 2 d,使用前,混合均勻,在顯微鏡下(400 倍)觀察是否有孢子出芽,若有孢子出芽,則棄之不用。

5) 使用時,可用稀釋液適當稀釋。懸液試驗時實驗用菌懸液的含菌量為1×107 cfu/ml~5×107 cfu/ml。

6) 制備染菌樣片時染菌方法為滴染法,每片加菌懸液10μl。染菌后,置 37 培養箱內干燥(約 30min),或置室溫下自然陰干后再使用。

7) 回收菌數應達5×105cfu/片~5×106cfu/片,可依試驗要求確定。

2.1.1.9.4  試驗分組

試驗分為下列各組:

(1) 試驗組,按2.1.1.7.3規定,選定消毒劑濃度與作用時間,對受試菌種的殺滅能力進行測定。

(2) 陽性對照組,硬水代替消毒劑溶液,按2.1.1.7.3規定程序進行試驗。所得結果代表試驗體系中所含試驗菌的初始濃度,并以其計算消毒因子對試驗菌的殺滅對數值。

(3) 陰性對照組,觀察同次試驗用相關溶液和培養基有無污染。

2.1.1.9.5  試驗程序

常用殺滅試驗有:懸液定量殺菌試驗、載體浸泡定量殺菌試驗、載體噴霧定量殺菌試驗等。培養基對白色念珠菌為沙堡葡萄糖瓊脂,對黑曲霉菌為麥芽浸膏瓊脂(MEA)。其操作程序詳見 2.1.1.7。

活菌培養計數時,對白色念珠菌,在37培養箱中培養48h 觀察最終結果。對黑曲霉菌,在30℃培養箱中培養72h觀察最終結果。

2.1.1.9.6 評價規定

(1) 產品監督檢驗,按產品使用說明書指定的使用濃度和作用時間,重復試驗 3 次 ,對白色念珠菌和黑曲霉菌各次試驗的殺滅對數值均4.00,要求載體定量殺滅試驗,各次試驗的殺滅對數值均≥3.00,可判定該產品對真菌污染物消毒合格。

(2) 產品申報衛生許可檢驗,按產品使用說明書指定的使用濃度和 3 個作用時間,重復試驗3次,要求懸液定量殺滅試驗在產品使用說明書規定使用濃度與最作用時間,以及最作用時間的1.5倍時,各次試驗的殺滅對數值均應4.00,在產品使用說明書規定使用濃度與最低作用時間的0.5倍時,允許殺滅對數值<4.00,可判為實驗室試驗該產品對真菌污染物消毒的有效劑量。

用載體浸泡定量殺滅試驗評價殺菌效果時,在產品使用說明書規定使用濃度與最短作用時間,以及最短作用時間的1.5倍時,各次試驗的殺滅對數值≥3.00,在產品使用說明書規定使用濃度與最作用時間的0.5倍時,允許殺滅對數值3.00,可判為實驗室試驗該產品對真菌污染物消毒的有效劑量。

2.1.1.9.7 注意事項

(1) 黑曲霉菌試驗操作應在  級生物安全柜內進行,避免造成環境污染和操作者受污染。

(2) 其它注意事項見 2.1.1.7.8。

2.1.1.10  病毒滅活試驗

2.1.1.10.1 適用范圍

主要適用于消毒產品鑒定或日常監測。用具有一定代表性的、活的病毒及其細胞感染技

術,評價各種用途的消毒因子對測試病毒的殺滅效果。按此方法進行的試驗,只是對消毒因子的滅活病毒能力的重要方面進行驗證。

2.1.1.10.2 試驗器材

(1)試驗用病毒株:脊髓灰質炎病毒1型(poliovirus-Ⅰ,PV-Ⅰ)疫苗株;艾滋病病毒 1 型(HIV-1)美國株。

(2)宿主細胞:可采用VERO細胞系、BGM細胞、Hela細胞系或FL細胞系,作為PV-1的測試細胞。用含有人T 淋巴細胞白血病病毒 1 型(human T cell leukemiavirus 1,HTLV-1)基因的人淋巴細胞(MT4 株)作為HIV-1的測試細胞。

(3)細胞培養瓶與 96 孔培養板。

(4)恒溫水浴箱。

(5)二氧化碳培養箱。

(6)層流超凈工作臺。

(7)低溫冰箱(-20℃,-80℃)。

(8)液氮罐。

(9)倒置顯微鏡。

(10)離心機。

(11)可調移液器及配套一次性塑料吸頭。

(12)細胞維持培養基:見附錄A。

(13)細胞完全培養基:見附錄A。

(14)去離子水。

2.1.1.10.3 病毒懸液的制備

(1)從液氮中取出凍存的試驗用宿主細胞,在37℃溫水中迅速融化,用毛細吸管移植于含有細胞維持液的細胞管內,吹吸數次,使混勻,立即離心(3000r/min,3min),去上清液。再加入適當的細胞維持液,吹吸數次,使混勻,同上離心后,轉種于加有10ml完全培養基的培養瓶中。逐日觀察細胞生長情況,在細胞長滿單層時,用于消毒試驗。

(2)取出低溫凍存的試驗病毒毒種,37℃水浴融化,用細胞維持液作10倍稀釋,然后接種于已經長滿單層細胞的細胞瓶內,置37溫箱中,使與細胞吸附、生長。逐日觀察病變,待3/4細胞出現病變時,收獲病毒。

(3)將含有病毒及宿主細胞的培養液,在冰浴條件下,用超聲波(或反復凍融)破碎宿主細胞,釋放病毒。然后,盡快離心(6000r/min,15min)去除沉淀(主要為細胞碎片),上清液即為所需的病毒懸液。按每管1.0ml分裝于無菌離心管(1.5ml)中。

(4)取1支病毒懸液,按病毒滴度測定法,測定其病毒滴度。其余均冷凍保存于-80℃備用。

2.1.1.10.4 病毒滅活滴度計算方法

(1)終點稀釋法病毒感染滴度的計算

以半數細胞感染劑量(TCID50)表示。TCID50的對數值計算公式如下。

TCID50 對數值= 病變率高于50%組稀釋度的對數值 + 距離比例

(“病變率高于 50% 組”是指病變率超過50%的最低組,下簡稱“高于 50% 組”;“病變率低于50%組”是指病變率低于50%的最高組,下簡稱“低于50%組”)。

具體計算方法如下:

1)計算細胞病變率。先計數培養板上不同稀釋度樣本細胞病變發生與未發生的孔數,然后分別計算“細胞病變(-)”和“細胞病變(+)”的累積總計值。計算“細胞病變(-)”累積值時,由稀釋度低樣本組向稀釋度高樣本組累積;“細胞病變(+)”累積值則相反,由稀釋度高樣本組向稀釋度低樣本組累積〔見表 2-2〕。

各稀釋度樣本組“細胞病變(+)”累積總計值,除以該稀釋度樣本組“細胞病變(-)”與“細胞病變(+)”累積總計值之和即為其病變比,由之可得病變率(%)〔見表 2-2〕。

2)計算距離比例。距離比例可按下式計算:

 

 

 

 

3)計算舉例

設試驗數據如表 2-2 

表 2-2  某消毒劑對 HIV 滅活作用的測定結果

樣本

接種

細胞病變

累積值

病變比

病變率(%)

稀釋度

孔數

-

+

細胞病變(-)

細胞病變(+)

10-4

4

0

4

0

12

12/12

100

10-5

4

0

4

0

8

8/8

100

10-6

4

1

3

1

4

4/5

80

10-7

4

3

1

4

1

1/5

20

10-8

4

4

0

8

0

0/8

0

本例,高于 50% 組病變率(%)為80;低于50%病變率(%)為20;高于50%組稀釋度對數值為6。

 

 

 

TCID50 對數值 = 6+0.5 = 6.5

(2)噬斑法病毒感染滴度的計算

噬斑法病毒感染滴度,以噬斑形成單位數(pfu),簡稱噬斑數表示。計數方法同活菌培養計數技術(參見2.1.1.3)。

每毫升測試樣品中的病毒含量計算(pfu/ml)= 平板平均噬斑數×稀釋倍數

(3)平均滅活對數值的計算

平均滅活對數值按下式計算:設陽性(病毒)對照組平均病毒感染滴度(TCID50或pfu)的為N0,試驗(消毒)組平均病毒感染滴度(TCID50或pfu)為Nx。

平均滅活對數值 = log No-log Nx

2.1.1.10.5  殘留消毒劑化學中和法的鑒定試驗

(1)目  的

本鑒定試驗只在確定所選中和劑是否適用于擬進行的細胞感染法病毒滅活試驗。

(2)試驗設計原則

1) 通過所設各組試驗結果綜合分析,應可確定所用中和劑是否對測試消毒藥物有良好的中和作用,對試驗用病毒和細胞株是否有害或不良影響。

2) 根據試驗目的,選擇適宜的病毒株和細胞株。

3) 中和試驗用藥物濃度應為正式消毒試驗最高濃度。作用時間最短不得少于30s。

(3)試驗分組

在使用細胞感染法進行病毒滅活試驗時,對所用中和劑的鑒定,應進行以下各組試驗。其中,先進行預備試驗中的第 1組~3 組試驗,如中和劑與中和產物對細胞生長無影響,再進行以下的正式試驗。

預備試驗:

1)中和劑 + 細胞 → 培養

觀察所用中和劑對細胞的生長有無影響。

2)(消毒劑 + 中和劑)+ 細胞 → 培養

觀察中和產物溶液對細胞生長有無影響。

3)(消毒劑 + 細胞)→培養

觀察消毒劑對細胞生長有無影響。

正式試驗:

1)消毒劑 + 病毒懸液 → 接種細胞培養

觀察所試消毒劑對病毒有無抑制或滅活作用。

2)(消毒劑 + 病毒懸液) + 中和劑 → 接種細胞培養

觀察殘留消毒劑被去除后,病毒是否可恢復對細胞的感染作用。

3)中和劑 + 病毒懸液 → 接種細胞培養

觀察中和劑對病毒有無抑制作用。

4)(消毒劑 + 中和劑) + 病毒懸液 → 接種細胞培養

觀察中和產物,或未被完全中和的殘留消毒劑對病毒有無抑制作用或對檢測方法有無干擾。

5)病毒懸液 → 接種細胞培養

觀察病毒是否可正常生長,并將其結果作為陽性對照值。

6)未接種病毒的細胞 → 培養

觀察其生長是否正常。

(4)病毒懸液定量法中和劑鑒定試驗操作程序

根據試驗分組,準備足量有關器材,依次擺放,進行編號。各組分別用適宜大小容量的無菌定量吸管按以下程序吸取或添加試劑和試驗樣本。各組每吸一次試劑或樣本,即應更換一次吸管或微量移液器吸頭,以防相互污染。

1)預備試驗第 1 組。 將試驗用細胞,分別加入不同稀釋度的中和劑溶液,作用3 h~4h 后,吸去液體,另加細胞維持培養液,置37℃ 二氧化碳培養箱中培養。

2)預備試驗第 2 組。將試驗用細胞, 分別加入不同稀釋度中和產物溶液作用3h~4h 后,吸去中和產物溶液,另加細胞基礎培養液,置 37℃ 二氧化碳培養箱中培養。

3)預備試驗第 3 組。將試驗用細胞,分別加入不同稀釋度的消毒劑,作用 3h~4h后,吸去消毒劑,另加細胞維持培養液,置 37℃ 二氧化碳培養箱中培養。

4)正式試驗第 1 組。吸取雙倍濃度消毒劑溶液 0.5 ml 于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后,吸加 0.5 ml 病毒懸液,混勻。待作用至試驗預定的滅活病毒時間,加入1.0ml去離子水,根據試驗規定量,吸取該最終樣液 (或以對病毒無害的稀釋液作系列稀釋),進行隨后的病毒滴度測定。

5)正式試驗第 2 組。吸取雙倍濃度消毒劑溶液 0.5 ml 于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5min 后,再吸加 0.5ml 病毒懸液,混勻。待作用至試驗規定的滅活病毒時間,加入 1.0ml 中和劑溶液,混勻,作用 10min。進行隨后的病毒滴度測定。

6)正式試驗第 3 組。吸取 0.5 ml 去離子水于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后,再吸加 0.5 ml 病毒懸液,混勻。待作用10 min,加入 1.0 ml 中和劑溶液,混勻。進行隨后的病毒滴度測定。

7)正式試驗第 4 組。吸取雙倍濃度消毒劑 0.5 ml 于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后,加入 1.0ml 中和劑,再吸加 0.5ml病毒懸液,混勻,作用 10min。進行隨后的病毒滴度測定。

8)正式試驗第 5 組。吸取去離子水 1.5 ml 于試管內,置 20℃±1℃ 水浴中 5 min 后,再吸加 0.5 ml 病毒懸液,混勻。進行隨后的病毒滴度測定。

9)正式試驗第 6 組。將試驗用細胞,加細胞維持培養液后,置37℃ 二氧化碳培養箱中培養。

10)本試驗中對各種病毒的接種和檢測操作技術,若無特殊要求,按病毒學中各種病毒的常規培養和檢測方法進行即可。

(5)評價規定

試驗結果符合以下全部條件,所測中和劑可判為合格:

1)正式試驗中第 1 組無試驗病毒,或僅有少量試驗病毒生長。

2)正式試驗中第 2 組有較第 1 組顯著為多,但較第 3、4、5(組)顯著為少的試驗病毒生長。

3)正式試驗中第 3、4、5(組)病毒生長與原接種量相近。

4)正式試驗中第 6 組細胞生長正常。

5)預備試驗結果顯示,中和劑和中和產物,在正式試驗的最高濃度下對細胞生長無影響。

6)連續 3 次試驗取得合格評價。

(6)注意事項

病毒載體中和試驗法可參照上述懸液定量中和試驗程序,并按照病毒學原理進行適當修改后使用。

2.1.1.10.6 殘留消毒劑物理去除方法的鑒定試驗

病毒滅活試驗中的物理除藥法,首先稀釋法,其次為吸附柱法、分子篩柱法、載體沖洗法。

(1)分 組

1)消毒劑 + 病毒懸液 → 接種培養

觀察所試消毒劑對病毒有無滅活或抑制作用,對細胞正常生長有無影響。

2)(消毒劑 + 病毒懸液) + 除藥處理 → 接種培養

觀察去除殘留藥物后病毒可否恢復對細胞的感染作用。

3)病毒懸液 + 除藥處理 → 接種培養

觀察除藥處理對病毒滴度有無影響。

4)病毒懸液 → 接種培養

觀察病毒生長是否正常,并以該結果作為陽性對照值。

5)未接種病毒的細胞 → 培養

觀察細胞生長是否正常。

(2)懸液定量操作程序

1)第 1 組。吸取消毒劑 0.9ml 于試管內,置 20℃±1℃水浴中經 5min 后,吸加 0.1ml 病毒懸液,混勻。待作用至試驗規定的滅活病毒時間,根據試驗規定量,吸取該最終樣液(或用適宜的對病毒無害的稀釋液作系列稀釋的樣液),進行隨后的病毒滴度測定。

2)第 2 組。吸消毒劑 0.9ml 于試管內,置 20±1 水浴中經 5min 后,吸加 0.1ml 病毒懸液,混勻。待作用至規定的時間,對此液進行除藥處理,根據試驗規定量,吸取最終樣本 (或用適宜的對病毒無害的稀釋液作系列稀釋的樣液),進行隨后的病毒滴度測定。

3)第 3 組。吸取病毒懸液 0.1ml,加 0.9ml細胞基礎培養液,做除藥處理。根據試驗規定量,吸取最終樣本(或用適宜的對病毒無害的稀釋液作系列稀釋的樣液),進行隨后的病毒滴度測定。

4)第 4 組。 吸取病毒懸液 0.1 ml, 加細胞維持液 0.9ml,不加消毒劑亦不做任何除藥處理。根據試驗規定量,吸取該病毒懸液(或用適宜的對病毒無害的稀釋液作系列稀釋的樣液),進行隨后的病毒滴度測定。

5)第 5 組。 向未接種病毒的細胞管內,加入完全細胞培養基培養。 

(3)評價規定

試驗結果符合以下全部條件,所測物理除藥法可判為合格:

1)第 1 組無試驗病毒,或僅有少量生長。

2)第 2 組有遠較第 1 組為多,但明顯較 3組~5組為少的試驗病毒生長。

3)第 3、4、5 (組)試驗病毒生長量相近。 

4)連續 3 次試驗取得合格評價。

5)可使用病毒載體,按同樣的原理與操作步驟進行試驗,判定合格標準相同。

2.1.1.10.7 脊髓灰質炎病毒滅活試驗

(1)目的

測定消毒劑對脊髓灰質炎病毒(Poliovirus,PV)滅活所需的劑量,以驗證病毒污染物消毒實用劑量。

(2)實驗原理

用細胞感染法測定消毒劑作用前后(或實驗組與對照組)樣本中脊髓灰質炎的量。以細胞病變作為判斷指標,確定各組病毒的感染滴度,計算消毒劑對脊髓灰質炎的滅活率。

(3)試驗分組

1)試驗組。根據所測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量估計,設定適宜的濃度與作用時間組(不少于1個濃度,3個作用時間),對作用時間的設計應不短于30s。

2)陽性對照組。用去離子水代替消毒劑,按試驗組規定步驟加入脊髓灰質炎懸液進行試驗和培養,觀察脊髓灰質炎生長是否良好。

3)陰性對照組。用不含脊髓灰質炎的完全培養基作為陰性對照,觀察所用培養基有無污染,細胞是否生長良好。

(4)脊髓灰質炎懸液定量滅活試驗操作程序

1)從液氮中取出凍存的試驗宿主細胞,在37℃溫水中迅速融化,并用細胞維持液洗滌兩次后,轉種于加有10ml完全培養基培養瓶中。逐日觀察細胞生長情況,在細胞長滿單層時,用于消毒試驗。

2)取出低溫凍存的脊髓灰質炎-1毒株,37℃水浴融化,用細胞維持液作10倍稀釋,然后接種于含已經長滿單層細胞的細胞瓶內,置37℃溫箱中,使與細胞吸附、生長。逐日觀察病變,待3/4細胞出現病變時,收獲病毒。收獲時,將培養液取出,用超聲波或反復凍融破碎宿主細胞,盡快離心,并將含病毒的上清液按每管1.0ml分裝于無菌離心管(1.5ml)中,冷凍保存于-80℃備用。

3)取待測消毒劑,用滅菌硬水稀釋至所需濃度的1.25倍,于20℃±1℃水浴中備用。

4)取100μl有機干擾物質與100μl病毒原液混合,于20℃±1℃水浴中作用5min,加入0.8ml待檢消毒劑,立即混勻并記時。作用規定時間,立即取出0.1ml,加入中和劑中混勻;或用經鑒定合格的除藥方法處理。

5)陽性(病毒)對照組試驗中,用無菌去離子水代替消毒劑。

6)各組分別進行病毒滴度測定,可采用終點稀釋法或噬斑法進行。

7)試驗重復3次。

8)終點稀釋法操作步驟:先用細胞維持培養液對待滴定樣本做10倍系列稀釋,然后在96孔培養板上滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量,每個稀釋度做4孔(各孔中應該已經長滿單層的宿主細胞),在37℃,放置1h~2h,以確保殘留病毒全部吸附在細胞上。取出培養板,更換細胞維持培養液。繼續放入二氧化碳培養箱中(37℃,5%CO2)培養,逐日在顯微鏡下觀察細胞病變,連續觀察3d,逐孔觀察并記錄細胞病變情況。

終點稀釋法病毒感染滴度的計算:以半數細胞感染劑量(TCID50)表示。

9)噬斑法操作步驟:先用細胞維持培養液對待滴定樣本做10倍系列稀釋,然后接種于細胞培養瓶中,滴定各稀釋度樣本中殘留的病毒量。

接種細胞前,將生長致密的單層細胞中的培養液傾出,加入1ml待測樣品,放置37℃吸符1h~2h,傾出樣液,加入含0.8%瓊脂的細胞維持液3ml,冷卻后翻轉細胞瓶,放置37℃培養48h~72h。然后每瓶細胞加入2ml甲醛溶液固定數分鐘,用自來水沖洗后加結晶紫溶液染色數分鐘,沖洗干凈后計數。細胞瓶內圓形不著色的透明區即為一個蝕斑單位,每毫升測試樣品中的病毒含量計算:

pfu/ml=平板平均蝕斑數×稀釋倍數

注意:為了便于計數,病毒蝕斑數一般控制在每細胞瓶10pfu~30pfu。

(5)平均滅活對數值的計算

平均滅活對數值按下式計算:設陽性(病毒)對照組平均病毒感染滴度(TCID50或pfu)的為N0,試驗(消毒)組平均病毒感染滴度(TCID50或pfu)為Nx。

平均滅活對數值 = log No-log Nx

(6)評價規定

1)脊灰病毒滅活試驗,可用于評價醫療器械、食具、物體表面和皮膚用化學消毒劑對病毒的滅活效果。病毒的滅活滴度,應達到4個對數值。

2)在正常情況下,3次試驗的平均滅活對數值4.00,可判為對脊髓灰質炎病毒污染物消毒的實驗室試驗合格。同時,陽性對照組病毒滴度對數值應在5~7 之間。

(7)注意事項

1)操作人員應具有基本的病毒學實驗工作經驗,盡量使用移液器與無菌一次性吸頭。

2)在殺菌試驗中,每次均應設置陽性對照。

3)如使用病毒載體進行試驗,可參照上述懸液定量試驗程序,并遵照病毒學原理進行適當修改后使用。

2.1.1.10.8 艾滋病病毒滅活試驗

(1)目  的

測定消毒劑對艾滋病病毒(human immunodeficiency virus,HIV)滅活所需的劑量,以驗證對該病毒污染物消毒實用劑量。

(2)實驗原理  

用細胞感染法測定消毒劑作用前后(或實驗組與對照組)樣本中HIV 的量。以細胞病變作為判斷指標,確定各組病毒的感染滴度,計算消毒劑對 HIV 的滅活對數值。

(3)安全防護

試驗中要求采取嚴密防護措施。我國規定所有接觸 HIV 的試驗均需在生物安全三級(biological safety level 3,BSL 3)實驗室內進行,并制定有相應的安全防護措施。 在 HIV 滅活試驗時,必須嚴格按照有關安全規定進行。

(4)試驗分組

1)試驗組。根據所測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量估計,設立適宜的濃度與作用時間組(不少于1個濃度,3個作用時間),對作用時間的設計應不短于30s。所設組應能測出使 HIV 全部滅活所需的最低有效劑量(藥物濃度與作用時間)。

2)陽性對照組。用去離子水代替消毒劑,按試驗組規定步驟加入 HIV 懸液進行試驗和培養,觀察 HIV 生長是否良好。

3)陰性對照組。 用不含 HIV 的完全培養基作為陰性對照,觀察所用培養基有無污染,細胞是否生長良好。

4)消毒劑對細胞毒性組。 100μl 待測消毒劑,加入含有100μl 用完全培養基制備的MT4 細胞懸液(含細胞400 000 個/ml)的 96 孔培養板內。置二氧化碳溫箱(37℃)中培養 7 d,觀察細胞生長情況,確定消毒劑對細胞無毒性的最高稀釋度。

(5)HIV 懸液定量滅活試驗操作程序

1)從液氮中取出凍存的 MT4 細胞,在 37℃ 溫水中迅速融化,并用細胞維持液洗滌兩次后,轉種于加有 10ml 完全培養基培養瓶中。逐日觀察細胞生長情況,在細胞對數生長期時收獲細胞用于消毒試驗。

2)從液氮中取出凍存HIV-1毒種,接種于含10ml細胞懸液(含細胞700 000個/ml~800 000個/ml)培養瓶中。逐日觀察病變,待3/4細胞出現病變時,收獲病毒。收獲時,將培養液取出,盡快離心,并將含病毒的上清液按每管 0.5ml 分裝于無菌離心管(1.5ml)中,冷凍保存于-80℃備用。如不能立即離心,可暫將培養瓶冷凍保存于-20℃,并爭取盡快離心分裝。

3)取待測消毒劑,用無菌去離子水作 1:2、1:4、1:8 ...系列稀釋。視消毒劑的類型和實驗目的,確定最高稀釋度。為防止污染培養液,必要時在試驗前需將消毒劑過濾除菌。

4)取 50μl 待檢消毒劑,與 50μl 病毒原液混合。在規定溫度作用一定時間(根據試驗要求確定作用時間和溫度),立即加入0.9ml 用完全培養基制備的 MT4 細胞懸液(400 000 個/ml),在37℃,放置 40min,以確保殘留病毒全部吸附在細胞上。陽性(病毒)對照組試驗中,用無菌去離子水代替消毒劑;消毒劑對細胞毒性組試驗中,用無菌去離子水代替病毒。

5)取出反應管,立即采取去除殘留消毒劑處理。處理可用物理去除法或中和劑法(所用方法需先經試驗證明,既可有效去除殘留消毒劑,又對細胞和 HIV 無殺滅或抑制作用。

6)在 96 孔培養板上滴定樣本中殘留的病毒量。先在培養板(96孔)的各孔中,加入 100μl 用完全培養基制備的 MT4 細胞懸液(含細胞 400 000 個/ml)。同時,用完全培養基對待滴定樣本做 1:10 系列稀釋,然后取 100μl 稀釋好的樣本加入已含 MT4 細胞懸液的 96孔培養板內。每個稀釋度做 4 孔。

7)將按上述程序加液的 96 孔培養板,放入二氧化碳培養箱中(37,5% CO2),逐日在顯微鏡下觀察細胞病變。被感染細胞融合腫脹,出現多核巨細胞。 第 4 d,在各反應孔內補加 50μl 新鮮完全培養基。第7d,逐孔觀察并記錄細胞病變情況。

8)試驗重復 3 次。

(6)評價規定

1)對測試滴度的HIV,3次滅活試驗后均應不再檢出,此時的滅活對數值應≥4.00,可判為該消毒劑濃度與作用時間,對HIV污染物消毒的實驗室試驗合格。

2)在正常情況下,HIV陽性對照組病毒感染滴度(TCID50)對數值應在5~7之間。陰性對照組宿主細胞生長良好,并且無HIV 檢出。所用濃度的消毒液對宿主細胞生長無不良影響。否則,根據發現的問題,或調整 HIV懸液濃度,或選擇適宜消毒液濃度,或更換污染試劑和培養基,或改進其他有關條件后,重做試驗。

(7)注意事項  

1)操作人員應具有較豐富的病毒學實驗工作經驗,必須絕對遵守BSL3實驗室的安全制度。身體狀態欠佳,或有傷口時,應暫時停止工作。

2)有感染可能性的操作,均應在BSL3實驗室的層流負壓超凈工作臺中進行。

3)一旦發生事故,有病毒感染或污染環境的可能時,切莫驚慌,除立即進行妥善消毒處理外,并應盡快報告實驗室和單位領導。

4)本試驗周期較長,在全部過程中應注意防止樣本污染。

2.1.1.11 能量試驗

2.1.1.11.1目的

    測定連續加入細菌懸液對消毒劑殺菌作用的影響, 以驗證該消毒劑用于多次消毒污穢物品(含較多有機物),如浸洗拖布的消毒液、浸泡污染醫療器械的消毒液、浸泡洗手消毒液等實用劑量。

2.1.1.11.2  試驗器材 

(1) 試驗菌株 金黃色葡萄球菌 ATCC 6538 大腸桿菌  8099 銅綠假單胞菌 ATCC 15442

(2)磷酸鹽緩沖液 (PBS,0.03mol/L,pH值7.2~7.4)。

(3)標準硬水(硬度為 342mg/L):見附錄A。

(4)含中和劑營養肉湯培養基 (所用中和劑應為經試驗鑒定合格者,見 2.1.1.5)。

(5)細菌定量殺滅試驗所用器材 (見 2.1.1.7.2)。

2.1.1.11.3試驗程序

(1)試驗用菌懸液配制  選擇上述試驗菌中對所試消毒劑抗力強者作為試驗菌, 配制菌懸液。用標準硬水將酵母粉配成50mg/L 溶液 (pH值6.9~7.1)。然后,吸取試驗菌新鮮營養肉湯24h 培養物6.0ml,加于含 4.0ml酵母液試管中,混勻。依此配制成的菌懸液,所含菌量應為 106 cfu/ml~107cfu/ml。 

    (2)將待測消毒劑用硬水稀釋成A(1.5x)、B(x)、C(0.5x) 等3 個濃度的消毒液 (括弧中的 “x” 代表殺菌試驗所得有效濃度), 各取 3.0ml 分裝于無菌試管內。

    (3)第 1 次,取試驗菌懸液 1.0ml 加入到第 1 管 A 濃度消毒劑溶液內,立即混勻。

    (4)在 A 管加菌懸液后8min,分別吸取A管內混合液20μl移種至A組的第1批5支盛有5.0ml 含中和劑營養肉湯培養基管中。

    (5)在第1 次加菌懸液后10min,第2次取1.0ml菌懸液加入到A濃度消毒劑管內,立即混勻。

    (6)在第2次加入菌懸液后8min(即第1次加菌懸液后18min) 時,分別吸取 A 管內混合液20μl移種至 A 組的第2批5支盛有5ml 含中和劑營養肉湯培養基管中。

    (7)在第2次加入菌懸液后10min(即第1次加菌后20min),取1.0ml 菌懸液加入到 A 濃度消毒劑管內,振搖混勻。

    (8)在第3次加入菌懸液后8min(即第1次加入菌液后28min) 時, 分別吸取 A 管內混合液20μl移種至A組的第3批5支盛有5ml 含中和劑的營養肉湯培養基管中。

(9)B(x)、C(0.5x)兩濃度藥液的試驗內容和操作程序,與上述A濃度者相同。3個稀釋度消毒藥液同一批進行操作時,可按表2-3 規定的時間和順序進行。

表2-3 能量試驗操作時間

     加菌與移種次序                            各濃度組操作時間(第 X min)               

                                   A                     B                       C           

       第 1 次加菌 0 1 5

       第 1 次移種(5 管) 8 9 13

       第 2 次加菌 10 11 15

       第 2 次移種(5 管) 18 19 23

       第 3 次加菌 20 21 25

        3 次移種(5 管) 28 29 33            

(10)以2支含5ml中和產物 (用同次試驗所用消毒劑與中和劑配制) 的營養肉湯培養基管,加入5μl試驗菌液,作為陽性對照。

(11)以2支含 5ml與上相同的中和產物的營養肉湯培養基管,作為陰性對照。

(12)將以上各試驗組和對照組樣本管,置 37℃ 培養箱中培養 48h,觀察是否有菌生長

(13)所有試驗均在20℃±1℃ 水浴中進行。

(14)重復上述試驗,每日1次,以連續取得3次同一評價結論者為準。

(15)試驗中應將試驗用菌懸液進行活菌培養計數,其長菌量應在106cfu/ml107cfu/ml。陽性對照管應變渾濁,陰性對照,不應有菌生長。

對照組結果不符合要求時,應檢查原因,改正后重新進行試驗。

2.1.1.11.4  評價規定

當陽性對照管有細菌生長(混濁),陰性對照管無菌生長(透明)時,第 1 次和第 2 次移種的 5管樣本中,有2 管或 2管以上不長菌的濃度組,作為合格濃度組。如 3 個濃度組均合格, 應降低消毒劑濃度繼續試驗; 反之,3個濃度組均不合格,則增加消毒劑濃度,直至找到最低合格濃度。連續3次重復試驗,得到同樣最低合格濃度,該最低合格濃度可作為設定反復浸泡用消毒液實用濃度的依據。

2.1.1.11.5  結果舉例

設對某消毒劑能量試驗結果如表2-4。

表 2-4  某消毒劑能量試驗結果

試驗序號

消毒劑濃度

3 次加菌后移種 5 管肉湯中細菌生長情況

 

 

(%,v/v)

(1)

(2)

(3)

1

0.6

―――――

+++++

+++++

 

 

1.2

―――――

―+++―

+++++

 

 

1.8

―――――

―――――

―――――

2

0.6

+―+++

++――+

+++++

 

 

1.2

―――――

―――++

+++++

 

 

1.8

―――――

―――――

―――+―

3

0.6

――+++

++―++

+++++

 

 

1.2

―――――

+――――

+++++

 

 

1.8

―――――

―――――

―――――

注:  "+" 表示有菌生長, "-"表示無菌生長。

結論:此次試驗結果,該消毒劑的最低合格濃度為1.2%。

2.1.1.11.6  注意事項

(1)試驗應選用規定菌株。

(2) 3 個消毒劑濃度組操作,應嚴格按表 2-3規定的時間進行。

2.1.1.12 各種因素對消毒劑殺菌作用影響的測定

2.1.1.12.1  目  的

了解有機物、溫度和 pH 對消毒劑殺菌作用的影響規律,為制定消毒劑的實用劑量提供參考。

2.1.1.12.2  試驗器材

(1)菌片與菌懸液(按 2.1.1.2 要求和方法制備)。

(2)恒溫水浴箱。

(3)冷水浴裝置(可放入試管架的容器,以冰水調節水溫)

(4)溫度計。

(5)pH 計。

(6)有機物,根據消毒劑的使用對象選擇,如酵母粉、血清、蛋白胨。

(7)中和劑(經中和劑試驗鑒定合格)。

(8)鹽酸(用無菌蒸餾水配制)。

(9)氫氧化鈉(用無菌蒸餾水配制)。

2.1.1.12.3  試驗微生物的選擇 

根據所測消毒劑鑒定需要決定。一般情況下,除需用于特定微生物者外,對細菌繁殖體應選擇大腸桿菌和金黃色葡萄球菌,作為革蘭陽性與陰性細菌的代表即可;用作滅菌劑,可使用枯草桿菌黑色變種芽孢。

2.1.1.12.4  消毒液濃度和作用時間的設定

各種因素影響的測定,均用殺滅相應微生物試驗所得最低有效濃度,和 3個~4個作用時間進行殺滅試驗。在 3個~4個作用時間中,以該最低有效濃度所需的最短有效時間為第 1 時間(T),其后的第 2 時間為第 1 時間的一倍(2T)。依此,第 3 時間為 3T,第 4 時間為 4T。試驗結果應根據需要測出殺滅對數值達 5.00(消毒用)的最低有效劑量。必要時,可根據需要調整消毒劑濃度或作用時間,若第 1 時間較長(> 30min),可根據情況適當縮短作用時間的組距。對第1時間較短者(<5min),可根據情況適當延長作用時間的組距。

2.1.1.12.5  有機物對殺滅微生物效果影響的測定

(1)如以小牛血清為有機物代表,應設置無小牛血清對照組;含25% 小牛血清組;含 50% 小牛血清組等3組。各組所用消毒液濃度和作用時間,見2.1.1.12.4。

(2)以稀釋液配制的微生物懸液與無菌小牛血清,按 1:1 與3:1 比例混合,分別配成含50%與25%小牛血清的微生物懸液。此含小牛血清的微生物懸液,可用于懸液定量殺菌試驗,亦可滴染菌片進行載體定量試驗。

(3)試驗中根據需要,選擇懸液定量殺滅試驗或載體浸泡定量殺滅試驗之一進行測定即可。具體試驗程序根據微生物種類可參見2.1.1.7。

(4)其它有機物按此設計類推。各組試驗應重復 3 次,按相應微生物殺滅試驗計算殺滅對數值。

2.1.1.12.6  溫度對殺滅微生物效果影響的測定

(1)設置10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃等,以10℃為間隔。各組所用消毒液濃度和作用時間,見 2.1.1.12.4。

(2)對要求試驗溫度高于室溫者,用恒溫水浴箱(電熱)調節;低于室溫者用冷水浴裝置(加適量冰水)調節。當上述溫度調節裝置到達要求溫度后,放入裝有試驗樣液的試管,同時放入一含與試驗樣液等量蒸餾水并插有溫度計的試管。待試管內溫度計指示到達試驗所需溫度時,開始隨后的試驗。

(3)根據需要,選擇懸液定量殺滅試驗或載體浸泡定量殺滅試驗之一進行測定即可。具體試驗程序根據微生物種類可分別參見2.1.1.7。

(4)試驗重復 3 次,按相應微生物殺滅試驗計算殺滅對數值。

2.1.1.12.7  pH 對殺滅微生物效果影響的測定

(1)本項試驗根據所測消毒劑使用溶液的 pH 值,分為以下 3 組進行:

第 1 組 pH 值  x - 2

第 2 組 pH 值  x

第 3 組 pH 值  x + 2

[例如,所測消毒劑使用溶液的 pH 值為 7.8,則 3 組的 pH 值應為:第 1 組 5.8,第 2 組 7.8,第 3 組 9.8]。

各 pH 組所用消毒液濃度和作用時間,見 2.1.1.12.4。

(2)對消毒液 pH 的調節,先用 pH 計測定原消毒劑的pH,在偏酸時慢慢滴加氫氧化鈉溶液,偏堿時慢慢滴加鹽酸溶液以調整。隨時用pH 計測定消毒液的pH。當達到所要求的pH 后,停止調整,進行隨后的試驗。必要時,在pH 調整后可測定有效成分含量以觀察是否受到pH 變化的影響。

(3)根據需要,選擇懸液定量殺滅試驗或載體浸泡定量殺滅試驗之一進行測定即可。具體試驗程序見 2.1.1.7。

(4)試驗重復 3 次,按相應微生物殺滅試驗計算殺滅對數值。

2.1.1.12.8  評價規定

評價時,有機物影響試驗應以不含外加有機物組(直接用稀釋液配制微生物)的結果為對照;溫度影響試驗應以20℃±1℃ 組的結果為對照;pH 影響試驗應以消毒劑使用溶液pH組的結果為對照。

(1)該組第 1個~4 個作用時間的試驗,對所試微生物殺滅效果均合格,判為該組所試因素無影響。

(2)該組第 2個~4 個作用時間的試驗,對所試微生物殺滅效果合格,判為該組所試因素有輕度影響。

(3)該組第 3個~4 個作用時間的試驗,對所試微生物殺滅效果合格,判為該組所試因素有中度影響。

(4)該組只第 4 個作用時間的試驗, 對所試微生物殺滅效果合格,判為該組所試因素有重度影響。

(5)全部試驗對所試微生物殺滅效果均不合格,判為本試驗所試因素有嚴重影響。為取得消毒或滅菌的有效劑量,需增加消毒液濃度或作用時間,重新進行試驗。

2.1.1.12.9  注意事項

(1)本試驗目的是為制定消毒劑實用劑量提供必要的參考數據,系統研究各種因素對消毒劑殺滅微生物效果的影響,尚需作更多系統的觀察。

(2)為加強各組結果的可比性和可重復性,非觀察因素應保持穩定不變。例如,在觀察有機物的影響時,除有機物濃度根據需要改變外,其他如溫度和pH等因素均應先后一致。

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